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HRM法基因定性分析原理

發布日期:2016年09月18日   瀏覽次數18058

    基因的定性分析,就是指諸如單核苷酸多態性(SNP)分析、基因突變分析、純合子篩查等基因分析方法。與基因的定量分析不同,定性分析大多無需知道基因的表達量,而是需要了解樣本中目的基因的序列。傳統的基因定性分析可用Southern Blot、PCR、DGGE、RFLP和測序等方法,但是這些方法要么耗時較長,要么通量較低,要么精度不夠。高通量測序及基因芯片技術雖然能夠滿足高精度、高通量的檢測要求,但是對于只針對特定位點的研究來說成本較高。長久以來,科研人員都在尋找一種簡便而精確的、可在實驗室操作的基因定性分析方法。

    雖然熒光定量PCR是應基因定量的要求而發展出來的技術,但是隨著化學等其他學科的進步,現今利用熒光定量PCR技術進行基因的定性研究已經成為現實。與傳統方法相比,利用熒光定量PCR檢測基因序列更加準確和高效,在目前的基因定性分析中有著越來越廣泛和深入的應用。

    最先應用于定性檢測的是熒光探針。因為熒光探針的分辨率高,能夠區分單堿基差異,適合SNP或者基因突變的檢測。根據特定位點的兩種不同序列設計兩種不同的探針,分別用兩種熒光標記,再對目的樣本進行熒光定量PCR檢測,由兩種熒光信號的比例即可計算不同序列的含量和比例。然而,熒光探針合成麻煩、周期長、成本高,與測序相比試驗周期和成本并未明顯降低。所以,人們一直尋找利用熒光染料進行基因定性檢測的可能。飽和染料的發現,以及隨之誕生的高分辨率熔解(High Resolution Melting,HRM)分析方法,為染料法基因定性分析提供了基礎。

    常用的熒光染料(如SYBR Green等)在濃度高的時候會對PCR過程產生抑制,所以在熒光定量實驗時的使用濃度較低。此時,染料不能占據DNA雙鏈上的所有的位置,換句話說,染料與DNA的結合是不飽和的。這些染料稱為“非飽和染料”。當制作熔解曲線時,隨著溫度的上升,雙鏈逐漸解鏈,染料會從已解開的單鏈上脫落,然后結合到臨近的尚未解鏈的雙鏈中沒有染料的小溝上去,繼續發出熒光。這種現象稱作染料的“重排”(圖1)。重排導致在較小的溫度變化范圍內,雖然DNA雙鏈的解鏈程度不同,但熒光值是幾乎不變的;也就是說,熔解曲線不能精確反應雙鏈的解鏈情況。所以,對于非飽和染料,其熔解曲線分辨率相對較低,只能區分特異性或非特異性的產物,不能分辨單堿基的差異。

    與此相對,另外一些熒光染料如LC Green、Eva Green等,對PCR的過程無抑制,所以在體系中可以以高濃度存在。此時,DNA雙鏈中的所有可結合位點內都會有染料分子存在,染料與DNA的結合呈飽和狀態,所以這種染料稱為“飽和染料”。在溫度上升、雙鏈解鏈、染料脫離的過程中,未解鏈的雙鏈部分不存在染料可以結合的位點,染料不能發生重排。所以,使用飽和染料制作的熔解曲線分辨率很高,可以精確反映DNA雙鏈隨著溫度的解鏈情況,不同熔解曲線的形狀就代表了不同的序列,精度可以達到單堿基差異的區分。

 
圖1. 非飽和染料(如SYBR Green)的“重排”現象導致在溫度變化幅度小、雙鏈部分變性時,熒光信號無明顯變化。而飽和染料則沒有重排現象,能夠分辨單堿基差異。

    采用飽和染料的HRM分析方法與探針法相比消除了背景信號,靈敏度進一步提高;同時,實驗設計更加方便,操作更加簡單,也無需合成和使用不同的熒光探針,調試時間更短,實驗成本也更低,非常適合對于特定多態位點的實驗室檢測。
    根據HRM分析的這些特點和要求,TIANGEN開發了HRM分析試劑盒(FP210)。該試劑盒采用Eva Green飽和染料,使用抗體修飾的熱啟動DNA聚合酶及精心優化的緩沖體系,增加反應的特異性和熔解曲線的穩定性,具有高分辨率和高模板適應性的特點,特別適用于已知SNP分析、未知SNP篩選、突變基因掃描和甲基化研究等基因定性分析研究(圖2)。


 
圖2. 使用TIANGEN血液基因組DNA提取試劑盒(DP318)提取100 μl人類血液樣本中的基因組DNA,以HRM分析試劑盒(FP210)進行PCR檢測。檢測24個不同個體,使用體系為20 μl,模板量為50 ng。結果顯示,相同基因型熔解曲線重復性高,不同基因型分辨明確,不存在誤判。可以看到,TIANGEN的HRM分析試劑盒是進行SNP檢測的理想試劑。

檢測的SNP信息如下:
RefSNP number:rs174538
Gene Name:FEN1(flap structure-specific endonuclease 1)
序列:CGCTCCGCCACCGGAAGAACACGTCG[A/G]CAGGAGCAGGCGCCTAGCACAACCG
Allele Frequency:A=0.314 G=0.686
根據該SNP位點兩側序列信息,設計引物:
FEN1_F:CCTCAACGCTCTCACCATTTTG;FEN1_R:GGCACTTCCTTTTCCGGTTGTG
擴增PCR產物長度為108 bp。
使用儀器為Roche LightCycler 480,收集熔解曲線的參數為:Ramp Rate 0.05,Acquisitions 12,用Gene scanning的方法分析。

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